Первая страница
Наша команда
Контакты
О нас

    Главная страница


Структурная реорганизация слуховой коры при височной эпилепсии 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология




страница1/6
Дата03.07.2017
Размер0.97 Mb.
ТипАвтореферат
  1   2   3   4   5   6


На правах рукописи

ДУДИНА Юлия Викторовна



СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ СЛУХОВОЙ КОРЫ ПРИ ВИСОЧНОЙ ЭПИЛЕПСИИ
03. 00. 25 – гистология, цитология, клеточная биология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Владивосток – 2008


Работа выполнена в ГОУ ВПО «Владивостокском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»


Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович



Официальные оппоненты:

доктор медицинский наук, профессор Рыжавский Борис Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор Елисеева Екатерина Валерьевна

доктор медицинских наук Кириллов Олег Иванович



Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ярославская государственная

медицинская академия Росздрава»

Защита состоится «_________»______________2008 года в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета.
Автореферат разослан «____» _________ 2008 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,

Доктор медицинских наук, профессор Рева Г.В.



Актуальность проблемы. Несмотря на достижения современных нейронаук остается открытым вопрос о патогенезе синдрома гипервозбудимости при эпилептическом поражении головного мозга у человека. Статистика указывает на непрерывный рост заболеваемости эпилепсией и закономерное преобладание парциальных припадков над первично-генерализованными.

Согласно данным Гехт и соавт. (2006) стандартизированная по полу и возрасту взрослого населения распространенность эпилепсии в России составляет 3,39 человек на 1000 населения. Среди выявленных пациентов 82,47% страдают фокальными синдромами эпилепсии (Мухин, Петрухин, 2005; Зенков, 2002; Henshall, 2007). При хирургическом лечении фармакорезистентных форм эпилепсий в 94,6% случаев очаг эпилептиформной активности локализуется в височной доле (Гайкова, 2001).

Механизмы эпилептогенеза в новой коре развиваются в условиях повышенной эффективности глутаматергической трансмиссии пирамидных клеток при снижении ГАМК-ергической активности тормозных интернейронов: корзинчатых клеток, клеток-канделябров и нейроглиеформных клеток (Дудина и др., 2006). Поврежденные («эпилептизированные») пирамидные нейроны генерируют сверхмощное возбуждение, которое реализуется в избыточной выработке глутамата и экстрасинаптической диффузии медиатора. В свою очередь, цитотоксическое действие возбуждающих аминокислот ведет к истощению ГАМК-ергических интернейронов, не способных ингибировать объёмный пул глутаматергической медиации (Dalby, Mody, 2001). В последние годы разработаны эффективные модели для изучения нейрофизиологических основ эпилепсии у человека. Результаты этих исследований свидетельствуют об изменении формы нейронов после генерации эпилептической активности и о разной чувствительности нейрохимических паттернов клеток к эпилептогенным веществам.

Гиперпродукция глутамата и его токсическое влияние на клетки-мишени со стороны патологически расторможенных пирамидных клеток инициируют нейродеструктивные процессы в эпилептическом очаге, которые реализуются посредством образования свободных радикалов, перекисного окисления липидов и индукции NO-синтазы. Чрезвычайно токсичным для нейронов остаются дериваты NO, особенно его недоокисленные продукты и пероксинитриты (Bao, Liu, 2003). Их накопление усиливает цитотоксические эффекты свободных радикалов с непременным развитием некроза и апоптоза нервных клеток, находящихся в зоне эпилептического повреждения. Исследование этих особенностей дает ключ к пониманию важнейших феноменов, ведущих к развитию эпилепсии.

Структурная реорганизация корковых нейронов вследствие перевозбуждения сводится к метаболическим изменениям цитоплазмы и синапсомодификации (Morris et al., 2006). Ранним признаком этого процесса является появление в дендритах включений различной степени плотности. Структурные изменения в фокусе ишемии показывают наличие неспецифических дистрофических и некротических изменений нейронов и синапсов, очаговые выпадения клеток, нейронофагии, разрежение нейропиля и глиоз. При эпилептическом статусе в височной коре крыс постоянно обнаруживается интенсивная реакция зрелых астроцитов с иммунореактивным глиальным кислым фибриллярным белком. Выработка белка является маркером раздраженных клеток, обычно сопровождается активацией трофических факторов, защищающих астроциты и нейроны от перевозбуждения и гибели (Hanbury et al., 2003; Дудина, 2003).

Протективные механизмы коры включают утилизацию глутамата глиальными клетками, индукцию нейрональной формы NO-синтазы, супероксиддисмутазы, нейротрофинов и антиапоптотических ферментов. На уровне отдельных нейронов и синапсов эти механизмы реализуются через локальную регуляцию гемодинамики, которую опосредуют нейровазальные мессенджеры и нейротрансмиттеры. Баланс нейротоксического и цитопротективного эффектов определяет избирательную устойчивость отдельных хемотипов нейронов к эпилептическому перевозбуждению и окислительному стрессу, что в перспективе может служить основой для разработки направленной фармакологической коррекций этих нарушений.



Диагностика нейронных структур, метаболизирующих NO и свободные радикалы, ведет к выяснению механизмов, возникающих при взаимодействии между синаптической медиацией определенных нейроанатомических паттернов и окислительным стрессом, что, вероятно, позволит вскрыть ключевые связи, которые развиваются в новой коре в период становления эпилептической активности. Перспективность этого направления связана также с выяснением динамики апоптоза корковых нейронов и его патогенетического значения при эпилепсии.

Целью настоящей работы является исследования гистофизиологии слуховой коры при парциальной эпилепсии и установление роли апоптоза и окислительного стресса в механизмах эпилептогенеза.

Задачи исследования:

  1. Установить значение структурных изменений внутримозговых сосудов при эпилепсии.

  2. Исследовать гистофизиологию нейронов и глии и участие апоптоза в развитии феномена гипервозбудимости при эпилепсии.

  3. Исследовать топохимическое распределение конститутивной и индуцибельной NO-синтаз и кальций-связывающих белков в эпилептических очагах.

  4. Изучить изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы) как возможно наиболее ранних признаков поражения нейронов при развитии эпилептогенеза.

  5. Исследовать миелиновые волокна в зонах белого вещества, прилежащих к эпилептическому очагу.

  6. На основе собственных и литературных данных обосновать патогенетическое значение структурной реорганизации слуховой коры, апоптоза и оксида азота в развитии височной эпилепсии.

Научная новизна и теоретическое значение работы: а) впервые на материале височной коры человека проведен комплексный анализ локализации и активности ферментов, запускающих механизмы окислительного стресса и цитотоксичности от эпилептического перевозбуждения; б) изучено состояние оксиредуктаз и гидролаз в эпилептических нейронах; в) проведен анализ участия ГАМК/NO-ергических нейронов неокортекса в формировании судорожной реакции; г) проведена иммуноцитохимическая диагностика кальций-связывающих белков – кальретинина, кальбиндина и парвальбумина – в височной коре крыс с каинат-индуцированной эпилепсией, установлена нейрохимическая гетерогенность ГАМК-ергических корковых нейронов и дана их детальная количественная характеристика; д) описаны морфологические изменения внутримозговых сосудов в эпилептогенном фокусе и в зоне его проекции, а электронномикроскопическое исследование капилляров и гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в микрососудах позволило установить характер поражения микроциркуляторного русла при парциальной эпилепсии у человека и экспериментальных животных; е) впервые на материале головного мозга человека и крысы описана динамика апоптоза корковых нейронов при судорожном синдроме; ж) впервые установлено наличие индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах эпилептогенного очага у человека при парциальной эпилепсии; з) исследованы глиальные реакции серого и белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага.

Полученные данные позволяют дополнить существующие концепции коркового эпилептогенеза. Выявленные изменения состояния NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы и цитохимических маркеров ГАМК-ергической нейропередачи достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на дискретные хемотипы нейронов. Данные по апоптозу поврежденных корковых нейронов у человека являются приоритетными. Результаты работы важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе формирования эпилептического статуса и разработки препаратов его фармакологической коррекции.



Практическая ценность работы: Полученные данные о значении апоптоза и окислительного стресса в развитии височной эпилепсии могут быть использованы в различных областях медицинской науки: нейрохимии, психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии и токсикологии. Эти результаты важны для выяснения патогенетических механизмов височной эпилепсии, а также для поиска и оценки фармакологических протекторов направленного действия.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Структурные изменения при локализации эпилептогенного очага в височной доле происходят в артериях, венах и капиллярах.

  2. Эпилептический очаг височной коры формируется не только в результате альтерации NO-ергических интернейронов, но и за счет повреждения пирамидных нейроцитов при индукции в них нитроксидсинтазы. Гибель нервных клеток происходит путем некроза и апоптоза.

  3. При синдроме гипервозбудимости отмечается раннее статистически достоверное изменение активности гидролаз (кислой и щелочной фосфатазы) и оксиредуктаз (цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы).

  4. Характер поражения NO-ергических тормозных интернейронов обусловлен содержанием в них различных кальций-связывающих белков (парвальбумина, кальретинина и кальбиндина).

  5. Эпилептическое поражение сопровождается демиелинизацией аксонов белого вещества головного мозга в проекции очага гипервозбудимости.

  6. Эпилептический очаг характеризуется выраженным глиозом белого и серого вещества, а астроциты экспрессируют NO-синтазу и NADPH-диафоразу.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на I Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2000; Международном симпозиуме «Сознание и наука: взгляд в будущее», г. Владивосток, 2000; конференции Института мозга РАМН «Организация и пластичность коры больших полушарий головного мозга», г. Москва, 2001; 4-ом Международном конгрессе по интегративной антропологии, г. Санкт-Петербург, 2002; Международной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения А.С. Догеля, г. Томск, 2002; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», г. Сургут, 2002; IV Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием, г. Владивосток, 2003; конференции: «Механизмы синаптической пластичности. Структурно – функциональные основы организации мозга в норме и патологии», г. Москва, 2004; I Международной научно-практической конференции «Научный потенциал мира 2004», г. Днепропетровск, 2004; Международном конгрессе по клинической патологии, Таиланд, 2005; Первом и Втором Международных Междисциплинарных Конгрессах «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2005, 2006; VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Орёл, 2006; IX Конгрессе Международной ассоциации морфологов, г. Бухара, Узбекистан, 2008.



Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликовано: 1 монография и 29 статей в отечественных и международных журналах и сборниках.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Объём диссертации составляет 293 страницы машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 таблицу, 18 рисунков и 211 микрофотографий. Библиографический указатель включает 427 источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы состояла в комплексном исследовании состояния нейронов височной коры человека и крыс в условиях эпилептической гипервозбудимости и оксислительного стресса. Для этого нейроны идентифицировали в соответствии с их морфологическим типом, медиаторной и нейрохимической специализацией. Определяли изменения активности NADPH-диафоразы, индуцибельной NO-синтазы (iNOS), кальбиндина, кальретинина, парвальбумина, кислой и щелочной фосфатаз, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, а затем исследовали апоптотический индекс корковых нейронов в фокусах эпилептического повреждения. Топографию нейронов, полученных на срезах, обработанных гисто- и иммуноцитохимическими методами, сопоставляли с соответствующими рисунками и схемами стереотаксических и цитоархитектонических атласов (Mannen, 1988; Paxinos, Watson, 1998; Светухина, 1962) и цитоархитектонического атласа коры больших полушарий человека, изданного Институтом мозга РАМН. Мякотные волокна исследовали на фронтальных и сагиттальных срезах белого вещества головного мозга человека и крысы в проекции эпилептогенного очага. Сосудистое русло височной коры крысы и человека исследовали с помощью рутинных гистологических методик и гистохимии кислой и щелочной фосфатаз.

Основной раздел работы составили исследования, выполненные на материале 35 нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария и аутопсийном материале мозга четырех людей, имевших в анамнезе височную форму эпилепсии.

Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 6.04.1993г.). Кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10.03.1996 г. № 163. Все эксперименты выполнены в соответствии правилами бережного обращения с лабораторными животными в соответствии с Приложением 4 к приказу № 755 МЗ СССР. Исследования начинали через 10-15 минут после забоя.

Образцы мозга человека получили при патологоанатомических вскрытиях трупов лиц (3-е мужчин и 1 женщина) в возрасте 63, 37, 43 и 34, лет, имевших в анамнезе височную эпилепсию (протоколы вскрытия № 391 от 17.10.06; № 187 от 21.11.06; № 189 от 23.11.06; № 93 от 02.12.2006).

Мужчина, 63 года. В анамнезе 9 лет назад тяжелая черепно-мозговая травма, в результате которой развилась симптоматическая эпилепсия с височной локализацией эпилептического очага справа (по данным ЭЭГ). Нерегулярно принимал бензонал, без эффекта. Отмечалась склонность к статусному течению заболевания. Смерть больного наступила после приема алкоголя в результате тотального геморрагического панкреонекроза, осложнившегося ферментативным и гнойно-геморрагическим перитонитом.

Мужчина, 37 лет. В течение 12 лет страдал психомоторными пароксизмами на фоне сохранного сознания, отмечались слуховые галлюцинации, явления ранее виденного, слышанного, приступы сопровождались явлениями деперсонализации и дереализации. На ЭЭГ – очаг эпилептифомной активности в височных отведениях слева. На МРТ – артериальная аневризма средней мозговой артерии слева. Смерть больного наступила в результате разрыва аневризмы и кровозлияния в левую гемисферу с прорывом в боковые желудочки.

Мужчина, 43 года. В анамнезе в 1994 году тяжелая черепно-мозговая травма с потерей мозгового вещества, ушиб головного мозга, перелом костей основания черепа. В последствии развилась битемпоральная посттравматическая парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками. У врача наблюдался, лечение получал (вальпроаты). Смерть больного наступила в результате инфаркта миокарда передне-перегородочного отдела стенки левого желудочка сердца, тромбоза передней нисходящей ветви левой венечной артерии.

Количество наблюдений, выполненных различными методами

Серии экспериментов



Количество наблюдений

А

Б

В

Г

Д

Контрольные животные










5




Каинатная модель эпилептогенеза













30

Импрегнация по методу Гольджи

4

5

3

4

26

Импрегнация по методу Кахаля

4

5

4

5

25

Окрашивание гематоксилином-эозином

4

5

5

4

21

Окрашивание железным гематоксилином

4

5

5

4

21

Окрашивание по методу Романовского-Гимза

4

5

5

4

21

Окрашивание по методу Ниссля

4

5

5

5

30

Окраска мякотных оболочек по Лизону и Даньелю

4

5

2

5

25

Выявление дегенерирующих мякотных нервных волокон по методу Марки

4

5

2

5

25

Иммуноцитохимия iNOS

4

5

4

5

25

Гистохимия NADPH-d

4

5

3

5

30

Гистохимия кислой фосфатазы










5

25

Гистохимия щелочной фосфатазы

4

5

5

5

25

Гистохимия сукцинатдегидрогеназы










5

25

Гистохимия цитохромоксидазы










5

25

Иммуноцитохимия кальретинина, кальбиндина, парвальбумина










5

25

Иммуноцитохимическое

определение апоптоза (метод TUNEL)



4

5

5

5

30

Окрашивание по методу Браше

4

5

5

5

30

Электронная микроскопия

4

3

1

1

5

Всего

183

556

739

А – материал мозга человека с височной эпилепсией; Б – контроль: височная кора человека; В – контроль – зрительная кора человека; Г – крысы (контроль); Д – крысы с каинат-индуцированной эпилепсией.



Женщина, 34 года. С детства страдала простыми и сложными парциальными эпилептическими припадками со вторичной генерализацией. На ЭЭГ – фокус эпилептиформной активности в правой височной доле. КТ – каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами. Наблюдалась в поликлинике по месту жительства с диагнозом: симптоматическая (каротидно-кавернозное соустье справа с аневризматически расширенными сосудами) парциальная эпилепсия с частыми полиморфными припадками с височной локализацией эпилептического очага справа, получала вальпроаты, лечение с незначительным эффектом. В декабре 2006 года больная доставлена в стационар в тяжелом состоянии. Выражена неврологическая симтоматика. Состояние без положительной динамики. Констатирована биологическая смерть. На патологоанатомическом вскрытии обнаружено субарахноидально-паренхиматозное кровоизлияние вследствие разрыва аневризмы с образованием внутримозговой гематомы в правой височно-теменной области, размерами 10*7*14 см, с прорывом крови в правый боковой желудочек и дно IV желудочка, осложнившийся отеком и дислокацией головного мозга.

Материал мозга человека (верхняя височная извилина и поперечные височные извилины правого и левого полушарий) исследовали не позднее 3-6 часов после наступления смерти. Для контроля использовали зрительную кору больных эпилепсией и материал мозга 5 человек, погибших в результате дорожно-транспортных происшествий, полученный при судебно-медицинских вскрытиях (височная и зрительная кора). Материал мозга человека исследовали в соответствии с законом РФ о погребении и похоронном деле от 08. 12. 95. Приложение 2. ст. I2; законом РФ о трансплантации органов и (или) тканей человека. 1992; основами законодательства РФ об охране здоровья граждан. 1993; методическими рекомендациями о консервировании трупов и отдельных органов в учебных целях (утверждены МЗ СССР) / Под ред. Г. В. Ковешникова, М.Г. Привеса. МР. Санина и др. М, 1948. - 15 с.; постановлении Совмина СССР N 630 oт 10 авг. 1972 г. (о передаче трупного материала и безродных трупов из лечебных учреждений институтам для учебных и научных целей; приказом МЗ СССР N 318 от 31 марта 1981 г. (о предоставлении права больницам, психоневрологическим интернатам, домам хроников, инвалидов и престарелых передавать трупы, не востребованные в течение 72 часов после смерти, институтам для учебных и научных целей).


  1   2   3   4   5   6

  • Научный консультант
  • Научная новизна и теоретическое значение работы
  • Практическая ценность работы
  • Положения, выносимые на защиту
  • Публикация результатов работы
  • МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • Количество наблюдений, выполненных различными методами