Первая страница
Наша команда
Контакты
О нас

    Главная страница


Обзор Содержание (предварительно) Содержание книги «Редактрование рнк, Гипотетические Механизмы и Контуры Новой Парадигмы»




страница7/12
Дата15.04.2017
Размер1.99 Mb.
ТипОбзор
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12
многократного испльзования их при формировании сплайсосомального интрона (Forget et. al., 2002).

У протистов (одноклеточных эукариот: простейших, одноклеточных красных и зеленых водорослей) набор генов мт-тРНК минимален по сравнению с таковыми в цитоплазме (кодируемых ядром) и пластидах. В связи с этим и наблюдается импорт тРНК в митохондрии протист. Обнаружен новый тип 5’-концевого редактирования по первым трем нуклеотидам акцепторного стебля мт-тРНК Acanthamoeba castellanii (Одинцова, Юрина 2002).

Матураза (matK) в составе интрона тРНК лизина хлоропластов ячменя редактировалась таким образом, что обеспечивала необходимый при сплайсинге предшественника фолдинг (Vogel et al., 1997). Интересно, что у грибов и животных, имеющих как правило по 22-24 тРНК-гена в митохондриях (Кузьмин, Зайцева 1986), предполагают существование общего эндосимбиотического предка. Однако филогенезы этих давно дивергировавших царств, выстроенные исходя из ядерных и митохондриальных рРНК здесь, не совпадали (Paquin et al., 1997).

К настоящему времени не доказано, что жизнь связана с единственным универсальным (УГК) генетическим кодом, а вся обнаруживаемая между видами гомология – с исключительно вертикальным (в ряду поколений) способом передачи и закрепления генетической информации. Поэтому любые современные филогенезы (а сохраненных нуклеиновых последовательностей возрастом в сотни миллионов, миллиарды лет не обнаружено), выстроенные по тем или другим ныне существующим последовательностям, могут отражать соотношения между организмами только в рамках современного УГК-кода во-первых. Во-вторых, не учтена возможноя роль процессов, связанных не только с вертикальной, но и горизонтальной передачей (Дейчман, Цой, Барышников 2005), особенно доминирующей, как считают (Woese 1981; Woese 2000), в ранне-эволюционный период (у одноклеточных и ранее).

…………………………………………………………….

……………………………………………………………………………..


7. Редактирование РНК в хлоропластах и митохондриях растений
В отличие от редактирования в митохондриях других царств, где для РНК различной природы уже многократно наблюдались cамые разнообразные типы редактирования (включая CU, но не А→I конверсии; U-вставки(чаще)/делеции(реже); а также редкие C-, U-, либо UU-, GU-, CU-, GА-вставки, и редкие А→G, U→А,G, GG→АА, C,U,G→ А, PurPyr замены), в хлоропластах и митохондриях (но не ядре) растений до сих пор наблюдали почти исключительно CU (гораздо реже UC ) тип редактирования, характерный, однако, и для кодируемых ядром последовательностей у животных (Sugiura 1995; Юрченко 1999; Gott et al., 1993; Vokobori , Paabo 1995; Tomita et al., 1996; Laforest et al., 1997).

Характерная особенность растительных клеток – одновременное присутствие 3-х геномов: ядерного, хлоропластного и митохондриального. Хлоропласты и митоходрии являются полуавтономными органеллами, содержащими все необходимые для экспрессии генов атрибуты (репликатвный и белок-синтезирующий аппараты). Продукты этих генов обычно включены в образование больших единых комплексов с кодируемыми ядром белками, а экспрессия 3-х геномов модулируется сложными регуляторными процессами, которые могут быть различными у фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих тканей (Douce, Neuburger 1989). Многие опубликованные данные описывают структуру и организацию геномов растительных органелл, включая полные хлоропластные геномы табака, риса, а у Marchantia polymorpha – и митохондриального генома, и др.

Достаточно много накопилось информации по транскрипции и процессингу транскриптов в хлоропластах; много меньше известно в отношении митохондриальных транскриптов растений, хотя в целом – это быстро развивающаяся область, и некоторые данные есть по биохимии транскрипции, РНК-полимеразам, факторам транскрипции, устойчивости и созреванию РНК, цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) и эволюции органелл. Хотя в целом биохимия редактирования РНК в органеллах растительных клеток практически не изучена. В некоторых случаях отсутствие редактирования может вести к получению растений с мутантным фенотипом, или с ЦМС (=CMS) фенотипом. Более детальное описание процесса редактирования РНК и организации геномов клеточных органелл высших растений и водорослей можно найти в обзорах (Одинцова, Юрина 2000; Одинцова, Юрина 2003).
Органеллы обладают значительным числом общих особенностей: наличие моно- и мультицистронных транскриптов РНК, некоторые гены прерывисты, а зрелые транскрипты образуются цис- или транс-сплайсингом. Гомологичные гены у различных видов очень консервативны, т.е. сохраняется значительная гомология их первичных структур (Grienenberger 1993). Дальнейшее усложнение в понимании процессов протекающих в растительных клетках началось открытием in vitro РНК-редактирования (CU, и редких UC конверсий) в митохондриях (Covello et al., 1989; Gualberto et al., 1989), а затем и в хлоропластах (Hoch et al., 1991; Kudla et al., 1992), но не в ядре. У животных же данный тип конверсии показан для кодируемого ядром и экспрессируемого во многих тканях аполипопроте- ина-Б.
В митохондриях растений есть гены, где используется генетический код с отклонением от универсального. Так в белковом продуте сох-2 гена кукурузы (и в отличие от его митохондриального ананалога у дрожжей и быка) положение триптофана соответствовало не только каноническому UGG, но и CGG-кодону аргинина (Fox et al., 1981). Различия у последовательностей сох-3 гена и кДНК его транскриптов в Oenothera сначала были восприняты как артефакт (Heisel, Brennicke 1987). В дальнейшем, однако, стало ясно, что C→U конверсии возникают реально (Covello, Gray 1989; Gualberto et al., 1989; Lamattina et al., 1989). В других генах, и у других растений использование CGG кодона также (но не на 100%) было связано с отклонением от универсального кода, хотя, как в случае митохондрий фасоли (Marechal et al., 1987), было показано, что есть только одна тРНК, и один ген тРНК триптофана в геноме, и что редактирование в митохондриях растений – широко распространенное явление.

В то же время в митохондриях зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, где рядом с геном рРНК обнаружены ген ND1 (субъединицы-1 дыхательной НАДН-дегидрогеназы) и ген ревертазо-подобного белка (Boer, Gray 1988), и у печеночника M.polymorpha, редактирования не обнаружено (Oda et al., 1992; Ohyama et al., 1991). Не редактировался и полученный в результате рекомбинации химерный Turf-13 ген Т-линии кукурузы с мужской стерильностью – вероятно вследствие избытка в нем фрагментов, гомологичных структурной 26S рРНК (Dewey et al., 1986), которая в митохондриях растений (кроме Oenothera), обычно, не редактируется. В случае 26S рРНК Oenothera было обнаружено 2 сайта редактирования (C→U и U→C); близкое расстояние между ними (всего 4 пары нуклеотидов) допускает возможность трансаминирования. В то же время последовательности 5S и 18S рРНК здесь строго соответствовали их генам. Из почти пяти сотен редактируемых в соb-гене сайтов Oenothera менее одного процента соответствовали UC, а все остальныеC→U конверсии. Однако и здесь, (как, впрочем, еще в нескольких случаях) существование U→C конверсий не было артефактом (Schuster et al., 1990). Всего до настоящего времени описано только четыре случая U→C превращений у высших растений. Это касается митохондриальных генов сох3 пшеницы, соb и сох2 Oenothera и сох2 гороха.

Редактирование многократно преобладало в кодирующей области. Смысл очень незначительного (менее 4%) редактирования транслируемых генов вне кодирующей области не ясен, но результатом предполагают увеличение стабильности транскрипта и усиление связывания его с рибосомой (Grienenberger 1993). В некодирующих частях митохондриальных транскриптов, как и в межгенных участках слитно транскрибируемых генов, сайтов редактирования мало, а интронные последовательности некоторых транскриптов подвергаются как цис-, так и транссплайсингу – что, вероятно, важно для корректного фолдинга их. Редактирование митохондриальных транскриптов высших растений очень распространено (известно более 1000 случаев), и касается всех истинно митоходриальных белок-кодирующих генов. Однако частота редактирования РНК геноспецифична: так продукт гена nad5 имеет 5.5 сайта, а orf206 (продукт которого участвует в биогенезе белка цитохрома-с) – 67.5 сайта на 1000 пар оснований. В белок-кодирующих нуклеиновых последовательностях обычно наблюдают равномерное распределение сайтов редактирования, хотя в отношении экзонов митохондриальных генов nad4 и nad5 пшеницы это не так. Редактирование трех кодонов аргинина (двух в orf575 и одного в orf240) в транскриптах двух участвующих в биогенезе цитохрома-с генов вело к появлению кодонов триптофана, и восстанавливало консенсусные белковые последовательности, по-видимому необходимые для связывания с геном (Одинцова, Юрина 2000).

Содержащие митохондриальные интроны класса II, транскрипты некоторых генов (сох2, nad1, nad2, nad4, nad5) подвергаются цис- либо транссплайсингу. На сплайсинг, однако, влияет предшествующая ему, и, вероятно, критическая для коррекции фолдинга CU конверсия (Michel et al., 1989). Далее модифицируется вторичная структура комплементарно взаимодействующих нескольких доменов (EBS1, EBS2) интрона (в частности – у сох2 гена пшеницы u кукурузы), и экзона (IBS1, IBS2). В результате, очевидно, формируется днРНК с несколькими качающимися G:U, а не комплементарными G:C парами, аналогичная той, что наблюдают для тРНК, рРНК, пре-мРНК (Grienenberger 1993). Способность к редактированию, как и в случае лизатов митохондрий пшеницы, зависит от ионов Mg2+, действия протеазы и повышенной температуры. Понижение температуры вело к уменьшению экспрессии, интронного сплайсинга и РНК-редактирования транскриптов cox2-гена пшеницы (Kurihara-Yonemoto, Handa 2001). Последовательности 3’-областей (не core-структуры) некотоых интронов II группы внутри мт-генов nad1 u nad7 цветковых растений неожиданно обнаружили большую чем обычную для этих интронов дивергенцию; домены 5 и 6 здесь имели более слабую спиральную структуру, устойчивость которой, однако, возрастала при (А:C)→(А:U) РНК-редактирующих преобразованиях. Для интронов II группы растение-специфические вариации нуклеотидов на РНК-уровне были большими (Carrillo et al., 2001), чем на ДНК-уровне (до 11 нуклеотидов у различных видов).

Некоторые митохондриальные гены (cox3, nad4, atp9, orf156 в пшенице, и др.) редактируются только полностью, тогда как другие (cox2, nad3, rps12 и rps13 Oenothera и пшеницы, и др.) обнаруживают, обычно, только частичное редактирование. По 13 сайтам (широко), и с образованием стоп-кодона, частично редактируется и транскрипт мт-гена субъединицы сукцинатдегидрогеназы (sdh4, ко-транскрибируемый с полностью редактируемым по 14 сайтам cox3-геном в последовательности длиной 1.1-4.4 тыс.осн.) картофеля, Solanum tuberosum L.(Siqueira et al., 2002). При этом одна часть сайтов каждого транскрипта подвергается CU конверсии (от 0 до 100%), а другая часть – сохраняет C без изменения (Grienenberger 1993). Из-за незаконченного процессинга и различной локализации кодона инициации (и др.), транскрипция у высших растений в митохондриях протекает как высокосложный процесс, сопровождаемый появлением множества молекул РНК (транскриптов одного гена) различных размеров (Mulligan et al., 1991). Между встречаемостью такого множества недопроцессируемых РНК и частично редактируемыми последовательностями есть корреляция. Сплайсируемые зрелые транскрипты обычно оказываются отредактированными полностью, а превалирующие недопроцессируемые транскрипты (как например содержащие интрон сох2 гены в Petunia и Мaize) – частично редактируемыми.

Считают, что только полностью отредактированные транскрипты дают начало уникальным последовательностям белка (Gualberto et al., 1991). Направление редактирования у частично редактируемых пре-РНК – в значительной степени случайное, т.е. без очевидно строгой 3’→5’ направленности характерной для U-вставок/делеций у трипаносом, но в явной параллели с процессами созревания и сплайсингом (Grienenberger 1993). Анализ распределения сайтов редактирования ко-транскрибируемых nad3-rps12 генов пшеницы показал, что полярность в редактировании РНК отсутствует. Редактирование РНК генерировало появление редатируемых полностью, частично, и нередактируемых форм транскриптов мт-RPS12-гена (у Petunia и др.) – что показано взаимодействием их белковых продуктов с соответствующими антителами. Сравнение эффективности редактирования митохондриального генома, одинакового у нескольких видов Petunia, позволило предположить влияние различного ядерного фона, ответственного за воспроизводство фактора, контролирующего стабильность транскриптов. Таким образом, считают, что митохондриальные растительные гены, транскрипты которых редактируются частично, могут кодировать более одного белкового продукта – т.е. формировать здесь т.н. белковый РНК-полиморфизм (Lu et al., 1996).

Один из фенотипов ЦМС получен на трансгенных линиях табака, продуцирующих белок, транслируемый с неотредактированной мРНК atp9 гена. При такой трансляции образуется белок, отличающийся по семи положениям от истинного, состоящего из 74 аминокислот. Вероятно именно конкуренция между истинным и модифицированным белками индуцирует синтез химерных АТPases, утрату способности образовывать АТP и ЦМС-фенотип (Hernould et al., 1992). Частично отредактированные транскрипты не только накапливаются в полисомной РНК митохондрий, но и транслируются. Аберрантные продукты трансляции могут деградировать и не формировать функциональных митохондриальных комплексов. Накапливаются же, как показано, только отредактированные продукты для АТP-синтазного и NADP•Н-дегидрогеназного комплексов, хотя в полисомных фракциях содержатся и частично отредактированные мРНК (Lu, Hanson 1994; Mulligan, Maliga 1998). Исследовали редактирование РНК для гомологичных последовательностей в урезанной химерной ОRF77 (расположенной по соседству с ОRF355) и atp9 мт-генов кукурузы с S-типом ЦМС, сопровождаемом коллапсом развития пыльцы по неизвестному механизму (Gallagher et al., 2002). Транскрипты atp9 гена редактировались полностью, а в ОRF77-транскриптах соответствующие нуклеотиды либо не редактировались, либо редактировались неэффективно из-за различий в фланкирующих последовательностях; неожиданное концевое редактирование в ОRF77 вело к усечению белка до появления 17-ти аминокислотного пептида (ОRF17).

В митохондриальном геноме цветкового растения Arabidopsis thaliana, исключительно в мРНК наблюдали 456 CU (не U→C) редактирующих сайтов: 441 в нескольких ОRF, 8 в интронах, 7 в лидирующих последовательностях. В какой-либо рРНК и нескольких тРНК редактирования не обнаружили. Частота редактирования индивидуальных кодонов в кодирующих областях колебалась от 0 до 19%. Некоторые малоиспользуемые кодоны редактировались по первым двум нуклеотидам, а значительной селекции нуклеотидов по соседству с редактируемым сайтом не обнаружили. В целом мРНК-редактирование здесь повышало гидрофобность кодируемых митохондриальных белков (Geige, Brennicke 1999).



В 86% случаев CU редактирования происходит изменение аминокислот в составе кодируемых митохондриальных белков pастений. Из них в 49% изменения затрагивают первый нулеотид кодона, в 30% - второй, и 7% касаются сохранения, фактически воссоздания из Про (CCU), консервативных Лей (UUR) и Фен (UUN) при двойной CCUU конверсии. Еще 14 % изменений нуклеотидов затрагивают третий (молчащий) нуклеотид кодона, и не имеют фенотипических проявлений. Заметим, однако, что в отличие от C→U замен, в случае Pur↔Pyr замен всегда (в двукодонных семействах, подсемействах), а в случае А↔G – дважды, это не может быть справедливым в отношении третьего нуклеотида кодонов. Инициирующий кодон (в частности для сох2 гена пшеницы, кукурузы, гороха и др.), как правило, формируется из кодона Тре(АCG)→Мет(АUG), а стоп-кодоны – из 2-х кодонов Глн (CАG→UАG, CАА→UАА) и кодона Арг (CGА→UGА). Также за счет редактирования образуется инициирующий (nad1 гена) и терминирующий (для atp9 и rps1 генов) кодоны митохондрий пшеницы, а большая часть изменеий касается кодирующей области. Редактирование в результате C→U (обычно единичных) транзиций в митохондриях растений характеризуется как механизм коррекции, ведущий к т.н. сохранению консервативных аминокислот белковых последовательностей – что особенно заметно при сравнении генов различных видов с гомологичными генами нерастительных организмов. Таким образом, может быть, решается не только проблема использования митохондриального генетического кода у растений, но и пост-транскрипционного сохранения функционально важных консервативных аминокислот. В то же время РНК-редактирование у неконсервативных позиций белковых молекул может быть показателем видоспецифических различий и роли аминокислот, как те, например, что важны для взаимодействия различных субъединиц комплексов дыхательной цепи (Grienenberger 1993).

Редактирование РНК в митохондриях обнаружили у всех исследованных видов покрытосеменных и голосеменных. Не обнаружили редактирвание у представителей Chlorophyta – зеленых водорослей и многоклеточных красных водорослей. Среди представителей Pteridophyta (папоротниковые) и Bryophyta (мховые) редактирование РНК в митохондриях обнаружено не у всех видов. Так для Bryophyta редатирование nad5 мт-гена выявлено у 30 видов мхов, 2 роголистников, 7 видов талломных и листовых печеночников. Интересно, что у роголистников часто встречались UC замены, а у листового печеночника Jungermanniidae в общей сложности редактировалось до 6% всех кодонов. Одновременно в обеих органеллах редактирование РНК отсутствовало у 7 видов сложных печеночников (Marchantiidae). Замены UC в митохондриях эволюционно более ранних папоротников встречаются значительно чаще, чем у высших растений (Одинцова, Юрина 2000).
Для хлоропластов высших и низших растений многих видов изестны полные нуклеиновые последовательности их кольцевых геномов, организация которых включает инверсии, инвертированные повторы, а также идентифицированные и неидентифицированные рамки считывания, нуклеотидные последовательности которых содержат гомологичные консервативные области. Для создания инициирующего кодона в экспрессируемых хлоропластных геномах высших растений также используется CU конверсионный механизм, когда АCG (Тре) кодон, содержащийся в генах rps12 (rр12) кукурузы, ndhD и psbL (субъединица фотосистемы-2) табака, модифицируется в инициаторный АUG (Мет) кодон. У некоторых видов в данной позиции кодон треонина заменен АUG кодоном и редактирования уже не требуется (Hoch et al., 1991; Grienenberger 1993; Tsudzuki et al., 2001). Этот же вид редактирования, с эффективностью в 20%, в пластидном rps14-транскрипте мха (Physcomitrella patens) создавал инициирующий (АUG) кодон, подтверждая возможность сильной зависимости регуляции белковой трансляции (здесь мРНК rps14) от РНК-редактирования (Miyata et al., 2002). Предполагают, что C↔U конверсионный механизм может вести к модификации вторичной структуры (стебель/петля), в частности в 5’-UTRs областях ndhG-транскрипта, и влиять на экспрессию гена. Кроме того внутри малой ОRF (в 12 кодонов) из межгенных (ndhI/ndhG) областей могут восстанавливаться консервативные кодоны (Drescher et al., 2002).

Сравнение высококонсервативных последовательностей гомологичных генов, в частности имеющего 4 сайта редактирования ndhA и nad1 генов различных растений, показало, что, во-первых, редактируются также и внутренние кодоны. Во вторых, у продуктов этих генов появляются высококонсервативные для многих видов лейцин (UUА, UUG) и фенилаланин (UUC). Таким образом в результате редактирования мРНК степень межвидовой консервативности некоторых участков белковых последовательностей увеличивается, что, вероятно, существенно для поддержания структуры/функции пептидов, кодируемых геномом ndhA. Частота встречаемости сайтов редактирования в нетранслируемых участках транскриптов хлоропластов гораздо ниже, чем в кодирующих аминокислотную последовательность. А говорить об полном отсутствии редактирования интронов в транскриптах пластомных генов пока рано, т.к. это обнаружено только для 5 из 18 интронов в генах rpl2, rps16, ndhA и ycf3 (Одинцова, Юрина 2000).

Характерной особенностью роголистников (Anthoceros formosae) является то, что в


1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12