Первая страница
Наша команда
Контакты
О нас

    Главная страница


Дополнительного педагогического




страница8/15
Дата15.05.2017
Размер3.46 Mb.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   15
Электрофорез продуктов амплификации ДНК в ПААГ. Для оценки количества и специфичности продуктов амплификации ДНК проводили электрофорез этих продуктов в вертикальных пластинах ПААГ (80х100х2мм). При электрофорезе ДНК в ПААГ в неденатурирующих условиях происходит разделение молекул в зависимости в первую очередь от их размера. Данный метод позволяет разделять молекулы, различающиеся по длине (обычно не менее чем на 5). Состав геля (общий объем 15 мл 8 геля): 10х буфер ТВЕ – 1,5 мл 10 персульфат аммония – 150 мкл ТЕМЕД – 12,5 мкл Дистилированная вода – 9,3 мл Акриламидная смесь, 30 (акриламид бис-акриламид) – 4 мл Буфер для образцов: 30 глицерин (vv) 0.025 ксиленцианол (wv) 0.025 бромфеноловый синий (wv) Электродный буфер: 1х буфер ТВЕ 1х буфер ТBE: 89 мМ Трис 89 мМ борная кислота (pH 8.0), 2 мМ ЭДТА В зависимости от необходимой концентрация ПААГ в буфер для геля добавляют различное количество 30 раствора акриламида (соотношение бисакриламид: акриламид=1:29). В работе использовали ПААГ с концентрацией 8. Напряженность поля при электрофорезе в ПААГ составляла 13 Всм. Приблизительное положение продуктов амплификации в ПААГ осуществляли с помощью наблюдения за миграцией лидирующих красителей, добавленных в буфер для образцов. Ксиленцианол в 1х буфере ТВЕ в 8 ПААГ мигрирует как фрагмент двунитевой ДНК размером приблизительно 160 п.н., а бромфеноловый синий – 60 п.н. Рестрикционный анализ. Для ферментативного гидролиза амплифицированного фрагмента 9-го и 11-го экзонов гена рецептора ЛНП использовали эндонуклеазы рестрикции и прилагаемый к ним 10-кратный реакционный буфер («Сибэнзим», Новосибирск) (Табл. 2). Использованные в работе эндонуклеазы рестрикции. Таблица 2. Эндонуклеаза рестрикции (прототип) Использованные изошизомеры Сайт узнавания Температурный оптимум BsrD I Bse3D I GCAATGNN↑ CGTTAC↓NN 55°С Hae III Hae III GG↑CC CC↓GG 37°С Гидролиз амплификатов проводили в пробах объемом 20 мкл. Эндонуклеазу добавляли из расчета 0,5 мкл (5 единиц) на пробу. Гидролиз ДНК рестрикционной эндонуклеазой проводили в водяном термостате “Multitemp” фирмы LKB в течение 2 часов. Фрагменты разделяли электрофорезом в 8 ПААГ. Гель после проведения электрофореза окрашивали бромистым этидием или серебром. Оценку размера полученных фрагментов проводили с помощью маркера молекулярного веса от 100 до 1000 пар с шагом 100 пар нуклеотидов фирмы «Медиген» (Новосибирск). Окрашивание ДНК в полиакриламидном геле бромистым этидием Гель помещали в емкость с водой и добавляли раствор бромистого этидия до конечной концентрации 0.5 мкгмл. Окрашивание проводили при покачивании 10 минут, реакцию окрашивания останавливали водой. Наблюдение флуоресценции проводили при освещении геля ультрафиолетовым светом. Окрашивание образцов ДНК нитратом серебра. Исходные растворы: Раствор А (окрашивающий): 0,1-ный раствор нитрата серебра (AgNO3). Для повышения чувствительности на 1 л раствора А можно добавить 1.5 мл 37-ного раствора формальдегида. Раствор В (проявляющий) на 100 мл: карбонат натрия (Na2CO3) 3 г 37 раствор формальдегида 150 мкл 1 раствор тиосульфата натрия (Na2S2O3) 40 мкл вода до 100 мл. Раствор С (фиксирующий): 10-ная уксусная кислота. Процедура: 1. Фиксировали гель в растворе С - 20 минут. 2. Промывали гель водой - 3 раза по 2 минуты. 3. Выдерживали гель в растворе нитрата серебра - 30 минут. 4. Промывали гель водой - не более 20 секунд. 5. Проявляли гель в растворе В до нужной степени окраски. 6. Останавливали реакцию окрашивания раствором С. Всю процедуру проводили на качалке. Замечания: 1. Проявляющий раствор В готовили непосредственно перед использованием. 2. Окрашивающий раствор А хранили в темном месте. 3. Окрашенный таким способом гель хранили в растворе С или в дистиллированной воде. Диагностика СГ в семье пробанда с помощью гетеродуплексного анализа и ПДРФ – анализа. При секвенировании амплифицированной ДНК пробанда №39 были идентифицированы две мутации: одна в экзоне 9, а другая в экзоне 11 (Таблица 3). Исходя из характера этих мутаций, можно было предсказать, что одна из них приведет к выпадению семи нуклеотидов и соответствующему сдвигу рамки считывания в мРНК гена рЛНП, а вторая –не скажется, скорее всего, на функционировании рецептора, так как представляет замену одного синонимичного кодона для изолейцина на другой. В нашем распоряжении имелась ДНК сестры пробанда, также страдающей гиперхолестеринемией (№38), а также предположительно здорового сына пробанда (№151). Нам предстояло провести семейный анализ и выяснить, кто из родственников пробанда унаследовал какую мутацию и сделать прогноз для сына пациентки №39. Ниже приводятся результаты исследования семьи пробанда на носительство двух обсуждаемых мутаций. Данные о пациентах с СГ, обсуждаемых в данной работе. Таблица 3. Номер пациента Пол Возраст Название мутации ИМ OXC, мМ ТГ, мМ ХС-ЛНП, мМ ХС-ЛВП, мМ Ka 38 Ж 26 c.1686del8insT (FsW562:L568X, [Fs W541:L547X])экзон 11 - 8,8 1,4 5,95 2 3,4 39 Ж 29 c.1686del8insT (FsW562:L568X [Fs W541:L547X])экзон 11 8,4-9 0,8 6,4 1,3 5,7 c.1194 C>T (I398I [I377I]) экзон 9 Ксантом и липоидных дуг роговицы у обеих пациенток не было. Ka - коэффициент атерогенности, определяли как (ОХС – ХС-ЛВП)XC ЛВП. Нормальное значение этого показателя - ниже 4 единиц. T> Детекция мутации с.1194 C>T Ранее у пациентки №39 из Петрозаводска была выявлена молчащая мутация c.1194 C>T (I398I, [I377I]) в девятом экзоне гена рЛНП. В коллекцию ДНК, созданную при выполнении данной работы, вошел генетический материал сына пациентки (№151). Для скрининга этой однонуклеотидной замены ранее была подобрана эндонуклеаза рестрикции BsrD I (использовали ее изошизомер Bse3D I производства компании “Сибэнзим”). В норме сайт узнавания для BsrD I отсутствует, а при мутации продукты амплификации размером 273 п.н. расщепляются на два фрагмента: 210 и 63 п.н. По результатам ПДРФ-анализа выяснилось, что сын унаследовал эту молчащую мутацию от матери. Уровень общего холестерина у сына – 2,87 мМ. Схема гидролиза амплификата экзона №9 эндонуклеазой рестрикции Bse3D I представлена на рисунке 3.1. Результаты ПДРФ-анализа представлены на рисунке 3.2. Рис. 1. Схема расщепления амплификата экзона 9 эндонуклеазой рестрикции Bse3D I. Стрелкой указано место расщепления амплификата при мутации c.1194 C>T. Рис. 2. Идентификация мутации c.1194 C>T методом ПДРФ-анализа. Дорожки: 1, 4 – образцы без мутации, 2 и 3 – образцы с мутацией c.1194 C>T, 5 – образец амплифицированной ДНК, не обработанный рестриктазой, 6 – результат ферментативного гидролиза ДНК фага λ эндонуклеазой рестрикции Bse3D I, М – маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н. Слева и справа подписаны размеры фрагментов, представленных на электрофореграмме. Под дорожками геля подписаны значения общего холестерина в плазме крови у двух сестер (№38 и №39) и у сына (№151). Электрофорез проводили в 8 ПААГ, окрашивание ДНК серебром. Детекция мутации c.1686del8insT Ранее в экзоне 11 гена рецептора ЛНП у двух сестер №38 и №39 была охарактеризована новая мутация c.1686del8insT (FsW562:L568X, [FsW541:L547X]) (Рис. 3.3 и 3.4). Мутация приводит к сдвигу рамки считывания. Как предсказано на основе анализа последовательности нуклеотидов через 6 кодонов после вставки образуется стоп-кодон и синтез белка должен обрываться. Нами был проведен анализ ДНК сына одной из пациенток на наличие данной мутации. В процессе амплификации образцов с мутацией образуются гетеродуплексы, выявляемые при электрофорезе продуктов ПЦР (рисунок 3.3, 3.5). Для выявления этой мутации также подходит эндонуклеаза рестрикции Hae III. В случае мутации один из двух сайтов рестрикции исчезает, и вместо трех фрагментов размером 76, 49, 44 п.н. на геле обнаруживаются две полосы, соответствующие размерам 76 и 93 п.н. Схема гидролиза амплификата экзона 11 эндонуклеазой рестрикции показана на рисунке 3.4. Результаты ПДРФ-анализа представлены на рисунке 3.6. По результатам ПДРФ- и гетеродуплексного анализа оказалось, что сын (№151) пациентки мутацию не унаследовал. Рис.3. Поиск мутации c.1686del8insT в экзоне 11 гена рецептора ЛНП Стрелка на дорожке 1 указывают на расположение однонитевых конформеров в образце с мутацией. Рисунок предоставлен н.с. Отдела молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН Т.Ю. Комаровой. Рис. 4. Идентификация мутации c.1686del8insT методом секвенирования. Показан результат секвенирования смысловой нити экзона 11 образца с мутацией. Под рисунком выписаны нормальная и мутантная последовательности гена рЛНП, начало их несовпадения при наложении на хроматограмме указано стрелкой. Рисунок предоставлен н.с. Отдела молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН Т.Ю. Комаровой. Рис. 5 Идентификация мутации c.1686del8insT в экзоне 11 гена рецептора ЛНП методом гетеродуплексного анализа . Гетеродуплексы при амплификации гетерозиготной по мутации ДНК образовывались спонтанно в процессе ПЦР. Дорожки: 1, 2 (две сестры, № 38 и 39) – образцы с мутацией; 3 ( №151 ), 4 – образцы без мутации, М – маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н. Под дорожками геля подписаны значения общего холестерина в плазме крови у двух сестер (№38 и №39) и у сына (№151). Справа подписаны размеры фрагментов, представленных на электрофореграмме. Электрофорез проводили в 8 ПААГ, окрашивание бромистым этидием. Рис. 6. Схема расщепления амплификата экзона 11 эндонуклеазой рестрикции HaeIII. Стрелками указаны сайты расщепления амплификата. Рис. 7. Идентификация мутации c.1686del8insT в экзоне 11 методом ПДРФ-анализа. Дорожки: 1 – маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.; 2 – образец амплифицированной ДНК, не обработанный рестриктазой HaeIII; 3, 4 – образцы (две сестры) с мутацией c.1686del8insT; 5 (сын пациентки) и 6 – образцы без мутации; 7 –результат ферментативного гидролиза ДНК фага λ эндонуклеазой рестрикции HaeIII. Слева подписаны размеры фрагментов, представленных на электрофореграмме. Дополнительные зоны в области 150 п.н. и 300 п.н. на дорожках 3 и 4 соответствуют гетеродуплексным фрагментам ДНК. Под дорожками геля подписаны значения общего холестерина в плазме крови у двух сестер (№38 и №39) и у сына (№151). Электрофорез проводили в 8 ПААГ, окрашивание серебром. Итак, Для диагностики мутации I377I в девятом экзоне гена рЛНП подобрана рестриктаза Bse 3DI и экспериментально показано, что с ее помощью может быть установлено носительство названной мутации. С большой вероятностью эта мутация не связана с развитием заболевания в семье. Для диагностики мутации 1686del8insT в одиннацатом экзоне гена рЛНП подобрана рестриктаза HaeIII и установлено, что, в отличие от сестры пробанда, сын пациентки мутации не унаследовал. Наиболее простым способом диагностики мутации 1686del8insT является, однако, не рестрикционный, а гетеродуплексный анализ, результаты по определению носительства мутаций с помощью которого совпадают с данными рестрикционного анализа и секвенирования ДНК.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   15

  • Рестрикционный анализ.
  • Окрашивание образцов ДНК нитратом серебра.
  • Детекция мутации с.1194 C>T
  • Детекция мутации c.1686del8/insT